旧“本草”不只是品种不全，而且还有很多错误。就拿唐慎微编写的当时医药界公认的全书《证类本草》来说，李时珍一方面称赞唐慎微的学问广博，肯定《证类本草》汇集了各家本草的药物和民间许多的单方、验方，使这些民间和古来的用药经验能够流传下来。但另一方面，李时珍觉得《证类本草》仍有不少瑕疵，如品种不全、分类杂乱、草木混淆，或一物误分为二，或二物误以为一，有的甚至误将毒药当做寿药。例如，它把葳蕤、女萎并入一条，这就是个差错。葳蕤是一种矮小的多年生草本植物，开白色的钟形小花，叶子像竹子，所以又名玉竹，是一种常用的滋补强壮药。女萎也称万年藤，茎长数丈，是止痢消食药，这两者是不可以混为一谈的。还有，生姜、山药是两种蔬菜，《证类本草》却把它们列入草部；槟榔、龙眼是两种果子，《证类本草》又把它们列入木本等等。
又如有的本草认为“黄精即钩吻”，“旋花即山姜”。黄精是一种补药，无毒，钩吻却有剧毒；旋花与山姜也是两种不同的植物，分属旋花科和姜科。把这些东西相互混淆就属于错加注释了。
更比如“水银”，据以前本草书记载，言其“无其毒”“其久服神仙”“为长生不老之药”等。确有其事吗？李时珍通过调查，认识到水银是由丹砂加热后分解出来的(就是所谓的“汞出于丹砂”)；水银和硫磺一起加热，可以变成银朱(硫化汞)；水银加盐等物，又可以变成另一种物质，名叫轻粉(氯化汞)。由此，在李时珍的记述下，水银终于回到了它本来的位置，他说水银是一种“温燥有毒”的物质，“若服之过剂，则毒被蒸窜入经络筋骨，变为筋挛骨痛，发为痈肿疳漏，或手足破裂，虫癣顽痹，经年累月，遂成疾癌，其害无穷。”李时珍又根据六朝以来久服水银而造成终身残废的历史事实，驳斥了久服水银可以长生不老的无稽之谈，并愤言道：“方士固不足道，本草岂可妄言哉。”
药的功效搞错了，就算医生处方开得再好也还是不能治病，甚至会引起医疗事故。
一天，一个渔夫满面愁容且焦急不安地前来请李时珍去他家给妻子治病。李时珍匆忙赶到渔夫家，只见渔夫的妻子面色灰白，精神恍惚，昏沉沉地躺在床上。原来，她患病后曾请过一位医生诊治，不料服药后病势反而加重了。李时珍用银针刺进急救穴位，病人发出了低微的呻吟声，接着“哇”的一声，吐出许多污秽之物，并慢慢睁开了双眼。
李时珍随后将原药方摊开再三推敲，觉得处方开得尚好，配方也无不妥之处。但病人服此药后，为何病情反而加重了呢？李时珍疑惑不解，会不会是抓错了药呢？他仔细查看药渣，发现了一味“虎掌”(天南星的叶子)，药方上没有。而药方中的“漏篮子”，药渣中却没有找到。疑团终于解开了，原来是药铺抓错了药！虎掌有大毒，被错当成漏篮子抓给病人了。为此，李时珍和渔夫一同赶到药铺。药铺掌柜对渔夫的叫骂不理睬，对李时珍的责备也不表态，他面无表情地用鼻子一哼，转身进屋拿出一本书朝李时珍面前一扔，冷笑着说：“本人自幼熟读本草药书，从无抓错之说。现有药书为证，请你过目！”李时珍仔细一看，原来是一本《日华子本草》。他翻开来查阅，书上清清楚楚地写着目漏篮子又名虎掌，二者为同一药物。李时珍大感意外，无话可说，在那里发愣。这次药物中毒的事例，使李时珍萌生了修正旧医书上的错误，增补新内容，写出一部新的本草的想法。因为一旦见错不改，任其自然泛滥，他将成为医学史上的千古罪人。
回到家里，李时珍把这一想法告诉了他的父亲。没想到父亲却颇有同感，把自己行医几十年所经历的类似事件也都讲述给李时珍听，然后感慨地说：“这也难怪，离现在最近的本草距今也有四百多年了，怎么可能符合今天的需要呢！”然后又望着儿子，若有所思地说：“可是，自唐朝以来，历代修本草都是朝廷的事，咱们只是空有良好的愿望，无法实现啊。”
李时珍略一沉思，说道：“对于个人来说，这件事情的难度确实太大了，可是，我们也很难争取到朝廷的支持啊……”
见父亲没作声，李时珍便对父亲笑了笑，挥着拳头坚毅地说道：“如果得不到朝廷的支持，那就多用点时间和精力，也不能因为没有朝廷的支持就让老百姓继续受苦啊。我一定要修订出一部完备正确的《本草》！几年不行，就用上十几年，几十年！”
接着，他奋笔写下了：
身如逆流船，
心如铁石坚。
望夫全儿志，
至死不怕难！
李时珍的父亲深知这件事非同小可，更深知这一工程的浩大和繁杂。但见儿子明理、志大、心诚、意坚，便表示愿意支持让他试一试。就这样，高度的责任感促使年轻的李时珍立下了宏伟志向，为自己的一生确立了一个艰辛而伟大的奋斗目标。
明世宗嘉靖三十一年（1552年），李时珍35岁，他开始着手编写《本草纲目》了。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状和生长情况。过去的本草书，虽然做了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去地做“纸上猜度”，所以越解释越糊涂，而且前后矛盾，莫衷一是。
这些难题该怎样解决呢？在父亲的启示下，李时珍认识到“读万卷书”固然重要，但“行万里路”更不可少。于是，一个既“搜罗百氏”又“采访四方”，深入实际进行调查的方案就此形成了。
李时珍穿上草鞋，背起药筐，在徒弟庞宪、儿子建元的伴随下远涉深山旷野，遍访名医宿儒，搜求民间验方，观察和收集药物标本。他首先在家乡蕲州一带调查，后来又多次出外采访，除湖广外，还到过江西、江苏、安徽等地。
李时珍非常注重调查研究，看重第一手资料，每到一地都虚心向各类人物请教。这些人中有采药的，也有种田的、捕鱼的、砍柴的、打猎的，他们都热情地与李时珍攀谈，帮助他了解认识各种各样的药物。
比如芸苔，是治病常用的药。但究竟是什么样的呢？《神农本草经》没有明确描述，各家注释也不详细。李时珍问一个种菜的老人，在他的指点下，又察看了实物，才确定芸苔实际上就是油菜。于是，这种药物便在他的《本草纲目》中得到了确凿的注解。
蕲蛇，即蕲州产的白花蛇。这种药有医治风痹、惊搐、癣癞等功用，李时珍早就开始研究它了。最初他只从蛇贩子那里观察，内行人提醒他——那是从江南兴国州山里捕来的，不是真的蕲蛇。那么真正的蕲蛇又是什么样的呢？他请教一位捕蛇的人，捕蛇人告诉他，蕲蛇牙尖有剧毒，人被咬伤后要立即截肢，否则就要中毒死亡。它对治疗一些病有特效，因此非常贵重，州官便逼着群众冒着生命危险去捉，以便向皇帝进贡。可蕲州那么大，其实只有城北龙峰山上才有真正的蕲蛇。
李时珍追根究底，要亲眼观察蕲蛇，便请捕蛇人带他上了龙峰山。山上有个狻猊洞，洞周围怪石嶙峋，灌木丛生，李时珍置危险于不顾，到处寻找，在捕蛇人的帮助下，终于亲眼看见了蕲州白花蛇。捕蛇人先向白花蛇身上撒一把土，说来也奇，蛇就像面粉遇到水一样缩成一团不动了。捕蛇人立即上前用木叉往白花蛇的颈部叉去，另一只手抓住蛇体的后部。这时的白花蛇再也施不出威力来了，被用绳子拴着倒挂在了树上。
李时珍上前仔细观察白花蛇的形态，只见蛇头大似三角形，嘴里长着四只长牙，背上有二十四块斜方格，腹部还有斑纹，与普通的蛇确实不一样。
接着，捕蛇人当场剖开蛇腹，去掉腹腔内的杂物，然后用水洗净蛇身，用竹签固定住蛇头，把蛇身盘成一团，用绳子系好。捕蛇人告诉李时珍：“就这样把蛇烘干即可成药。”捕蛇人还告诉李时珍一个辨别真假蕲州白花蛇的方法，他说：“别处产的白花蛇烘干时眼睛早已闭上，而蕲州白花蛇就不同，烘干后眼睛还睁着，就跟它活着的时候一样。”李时珍非常感谢捕蛇人对他的教诲。分手时，他还买了几条活的蕲州白花蛇，以便细致观察，亲自制药。
几年后，李时珍又根据白花蛇的祛风特性，制成了专治半身不遂及中风症的“白花蛇酒”。现代药理分析证明，白花蛇的提取物具有镇静、镇痛，扩张血管和降压作用。李时珍还把对蕲州白花蛇的研究成果写成一部书，叫《白花蛇传》。
鲮鲤，即今天所说的穿山甲，是常用的中药材。陶弘景在引证《名医别录》中说它为鲮鲤科动物的鳞甲类，性味咸凉，能够消肿溃痈，搜风活络，通风下乳，外用止血。还说它能水陆两栖，喜欢吃蚂蚁。白天它爬上岩来，张开鳞甲，装出死了的样子，引诱蚂蚁进入甲内，再闭上鳞甲，潜入水中，然后开甲让蚂蚁浮出，将其吞食。
为了了解陶弘景的说法是否正确，李时珍亲自上山去观察，并在樵夫、猎人的帮助下捉到了一只穿山甲，从它的胃里剖出了一升左右的蚂蚁，初步证实了陶弘景有关穿山甲食蚁的说法。不过，在以后的观察中，他却发现穿山甲并不是“诱蚁入甲，下水吞食”，而是搔开蚁穴进行舐食。李时珍肯定了陶弘景正确的一面，也纠正了其错误之处。
李时珍在蕲州雨湖之畔的住宅附近亲手开辟了一座药圃，名叫红花园，他在这里精心培植了各种药物。黄精是一味补虚益精的植物药，本是野生的，李时珍从山上采回以后，便在院内加以栽培。后来他介绍栽培经验时说：“黄精野生山中，亦可劈根长二寸，稀种之，一年后极稠，子亦可种。”他亲手试种的结果，说明黄精既可栽培，又可播其种子育苗栽植。红花是一味活血通经、祛瘀止痛的植物药，李时珍也曾栽培过。他说：“红花，二月、八月、十二月皆可以种下，雨后布子，如种麻法，初生嫩叶，苗亦可食。”“其子五月收采，淘尽捣碎煎汁，入醋拌蔬食，极肥美。”据他亲身种植的体会，认为栽种红花的方法就和栽植芋麻一样，而且红花的嫩苗和种子还可以充当美味的蔬菜。使君子是一味驱虫消积的植物药，主产于四川、云南、广东、广西等地，湖北各地很少见到，李时珍便把它加以引种。他说：“使君子原出南海，交趾，今闽之邵武，蜀之眉州皆栽种之，亦易生。其藤如葛，绕树而上。叶青如五加叶。五月开花，一簇二十葩，红色，轻盈如海棠。其实长寸许，五瓣合成，有棱。先时半黄，老则紫黑。其中仁长如榧仁，色味如栗，久则油黑，不可用。”尽管蕲州地方不产使君子，但由于李时珍亲自引种过它，因而对这种植物的生长过程及其特征了如指掌。
除了栽培药用植物之外，李时珍还饲养过药用动物。比如绿毛龟，它是一种补阴血益精气的动物药，因为是蕲州的特产，李时珍便养了几只。他通过亲手用水缸饲养，了解绿毛龟的生长过程和生活习性，并且将它与普通乌龟进行对比，准确地记载了这种乌龟的特点。我们知道，绿毛龟是一种背甲生基藻或刚毛藻等绿藻的金龟或水龟，其藻为绿色丝状分枝，长1—4厘米，在水中如被毛状，故名绿毛龟。绿毛龟又是一种珍贵的观赏动物，中外人士都很喜欢饲养它作为宠物，其经济价值很高。李时珍记录了饲养绿毛龟的方法，这是非常有意义的。
在太和五龙宫的后院有一种奇特的果树，每年长出像梅子大小的“仙果”。道士们说，果树是真武大帝所种，人吃了这仙果可以长生不老。皇帝闻讯，降旨下令五龙宫道士每年在“仙果”成熟时采摘作为贡品送到京城，供皇家享用，并不许百姓进五龙宫后院，谁要是偷看、偷采“仙果”，就是“欺君犯上”，有杀头之罪。
李时珍不信道士们的说法，要亲自采“仙果”来试试，看看它究竟有什么功效。便在其山下找一家客栈住下。次日，李时珍来到五龙宫，对寺院道长说：“我是从蕲州来的医生，专门采集药材研究药效的，听说贵寺有仙果，能否给我看一看？”老道长将李时珍仔细打量一番后说：“念你是个医生，不懂这里的规矩，我不想找你什么麻烦。但我要告诉你，这里是皇家禁地，仙果是皇家的御用之品。你还是快快离去为好，不然当心皮肉受苦。”再说什么都没有用了，李时珍无奈地下山。怎么办呢？难道让这“仙果”永远成为一个谜？
夜深人静，李时珍从另一条小道摸上了山。此时五龙宫内外一片寂静，道士们早已酣然入睡。他轻步绕到后院外，吃力地翻墙进入院内，捷步来到果树下，迅速采摘了几枚“仙果”和几片树叶。然后翻墙出寺，连夜奔下山去。
回到客栈，李时珍亲口品尝了“仙果”，并仔细对其进行研究，终于解开了太和山“仙果”之谜。原来它只不过是一种榆树果子的变种，名叫榔梅，功效跟普通的桃子、杏子一样，能生津止渴而已，并没有什么特殊之处。所谓的长生之说，纯属道士们为了讨好皇上而编造出来的一套谎言！
李时珍对药物的了解并不满足于走马观花式的调查，而是一一采视，对照实物进行比较核对，由此弄清了不少似是而非、含混不清的药物。用他的话来说就是“一一采视，颇得其真”“罗列诸品，反复谛视”。
有一次，李时珍经过一个山村，看到前面围着一大群人。走近一看，只见一个人醉醺醺的，还不时地手舞足蹈。一了解，原来这个人喝了用山茄子泡的药酒。“山茄子……”李时珍望着笑得前俯后仰的醉汉，记下了药名。回到家，他翻遍药书，终于找到了有关这种草药的记载。可是药书上写得都很简单，只说了它的本名叫“曼陀罗”。李时珍决心找到它，进一步研究。后来李时珍在采药时找到了曼陀罗。他按山民说的办法，用曼陀罗泡了酒。过了几天，李时珍决定亲口尝一尝，亲身体验一下曼陀罗的功效。他抿了一口，细品品，味道很香；又抿一口，舌头以至整个口腔都发麻了；再抿一口，人昏沉沉的。不一会儿，他也开始发出阵阵傻笑，手脚还不停地舞动着，最后竟失去了知觉，摔倒在地上。一旁的人都吓坏了，连忙给他灌了解药。过了好一会儿，李时珍醒过来了，大家这才松了一口气。醒来后的李时珍兴奋极了，连忙记下了曼陀罗的产地、形状、习性、生长期，写下了如何泡酒以及制成药后的服法、作用、功效等等。
有人埋怨他太冒险了，他却笑着说：“不尝尝怎么断定它的功效呢？再说了，总不能拿病人去做实验吧！”听了他的话，大家更敬佩李时珍了。
就这样，又一种可以作为临床麻醉的药物问世了。
李时珍的大儿子李建中，大约在明隆庆五年（1571年）任职河南光山县教谕。利用探望儿子这个机会，李时珍由蕲州取道麻城入豫，横越大别山脉，在长途旅行中，除去问药访医外，李时珍还做了一件有意义的事情，就是收集各地流传的单方，把它们一一记录下来。
李时珍有时和铃医交往，吸收他们的医疗经验。铃医有个特点，就是不会讲什么医理，只会凭经验，用现成的方子给人治病。所以他们手中大都掌握了多单方，其中也有不见于古人方书的秘方。
李时珍青年时期就注意单方，并深受宋朝名医唐慎微收集单方故事的影响。
唐慎微编著的《证类本草》古方最多，给其他的本草学书籍创造了一个范例。受了唐慎微的影响，李时珍对于单方的收集也很热心。他在蕲州给人治病时也常常不要钱，只要人家供给他一些秘方。
散布在广大民间的医药方子是我们祖先千百年来遗留下来的医疗经验，各处都有当地流传的一些单方。李时珍每一次外出，总能满载而归。
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