实验3.1入侵植物对本土植物的影响

    【实验目的】

    1.了解入侵植物对本土植物生长发育的影响，深刻理解生态入侵概念及其入侵机制。

    2.掌握植物浸提液的提取、制备方法。

    3.学会用常规的数理统计方法比较和分析实验结果。

    【实验原理】

    生态入侵是当今人类社会面临的一个自然现象。生态入侵是指人类有意或无意的行为，将某物种带入到一个比较适宜其生长的区域，由此导致该种群数量不断增加，分布区面积不断扩大的生态过程。生态入侵的物种被称作入侵种，近年在我国常见的入侵植物种有加拿大一枝黄花、飞机草（Eupatorium odoratum）、北美商陆（Phytolacca americana）、喜旱莲子草、脉草（Ambrosia artemisifolia）、微甘菊和银胶菊（Parthenium argentatum）等。

    生态入侵过程的实质包括两层含义：一是指入侵物种的种群数量不断增加；二是指入侵物种的分布区面积不断扩大。一个物种能否成功入侵取决于物种本身的生物学特征（如生长速度、竞争能力、繁殖方式、繁殖能力、扩散能力）、环境的可入侵性（是否缺乏天敌、是否具有空的生态位、气候条件或与原产地的相似度）以及人类活动的干扰强度等。从生活史对策看，生态入侵的物种一般具有r-对策。

    在生态入侵过程中，入侵物种的生长能力较强，并能产生大量的种子；其次，入侵物种常具有强大的营养繁殖能力（主要通过根状茎的拓展生境）；再者，入侵物种常通过淋溶、挥发、残体分解和根系分泌向环境释放化学物质，对周围植物（包括微生物）产生间接或直接有害或有利的作用，即化感作用。

    【实验仪器和材料】

    1.仪器和设备

    小锄、剪刀、培养皿、蒸馏水、烧杯、电子天平、纱布、滤纸、镊子、记录本、恒温箱等。

    2.材料

    在周边地区踏查，调查入侵植物种类和分布，可就近选取入侵物种，如加拿大一枝黄花、北美商陆、豚草、微甘菊和北美车前（Plantago virginica）等。然后再选取一些本地常见农作物，如萝卜、长梗白菜、番茄、辣椒、小麦等植物的种子供试键议选取1~2种）。

    【操作建议】

    1.取样：选取发育良好的正常入侵植物种若干株，分别采集各株植物地上的茎叶部分，并挖取其地下部分，洗净、自然风干后，混合，用剪刀剪成1~2cm碎片备用。

    2.浸提液的制备：称取剪碎的供体植物50~100g，放入烧杯中，分别加10倍重量的蒸馏水浸泡48h，其间可间歇振荡，三层纱布过滤后得到浸提液的原液（浓度为0.100 g·mL-1）。

    3.浸种与培养：将供试的作物种子先用0.5%的硫酸铜溶液浸泡1~2h后，再用蒸馏水冲洗干净。事先用0.15%的福尔马林溶液对培养皿灭菌，然后在培养皿内放置滤纸或纱布，在每只培养皿中放入选好的30~50粒健康饱满、大小均匀的作物种子，然后将培养皿放入22°C左右的恒温箱内进行培养。

    4.实验处理：入侵物种的地上部位和地下部位的浸提液均设0.025g·mL-1、0.05 g·mL-1、0.075g·mL-1，3个浓度梯度，用蒸馏水作为对照（CK）。每种实验做3个重复。在种子发芽生长期间，每天分别用蒸馏水以及入侵物种的不同部位的不同浓度的浸提液浇灌处理。

    5.数据统计记录：在种子培养期间，每天定时记录不同处理作物种子的发芽数（以幼根达到种子长作为萌发标志），按下式计算种子发芽率。

    发芽率=种子发芽数/种子数*100%

    从第二天开始，测定幼根的长度（mm）、苗高（mm）数据，计算根伸长抑制率、下胚轴伸长抑制率等。每个处理重复10次取平均值，分别填入表中。根伸长抑制率、下胚轴伸长抑制率分别用下式计算。

    根伸长抑制率=对照组对照组处理组根长*100%

    下胚轴伸长抑制率=（对照组下胚轴长－ 处理组下胚轴长）/对照组下胚轴长*100%

    6.数据分析：将实验记录数据整理后输入电脑。用Excel或SPSS 11.0软件检验分析（one-way ANOVA）不同处理之间的发芽率、根伸长抑制率、下胚轴伸长抑制率等的差异，包括入侵植物的不同部位（地上和地下部位）的不同浓度的浸提液对作物种子萌发和生长的影响及其差异显著性检验。绘制不同浸提液浓度与各作物种子萌发率、根伸长抑制率、下胚轴伸长抑制率等指标之间的关系图。

    【实验注意事项】

    1.不同物种的记录观察时间略有不同，如萝卜、长梗白菜和小麦可连续记录7天，番茄和辣椒可以连续记录14天。

    2.注意种子萌发后根和下胚轴的区别。发芽前（即实验第一天）幼根和下胚轴的界限并不明显，因此这两项指标从第二天开始计量。若幼根或下胚轴在生长过程中出现扭曲现象，可先用细线量出欲测指标的总长并做标记，然后用刻度尺测定。

    【实验拓展】

    实验拓展1入侵植物的群落结构调查

    外来入侵种在自然、半自然生态系统中定居下来，常影响群落的组成和结构，引起生态系统多样性、物种多样性、生物遗传多样性的变化，最终可能导致生态系统功能退化。很多入侵植物以种子和根状茎繁殖，常抑制生境中其他植物的生长；同时，如果本地群落为外来种提供了适宜的生境条件，特别是有利于外来种群生活史中关键阶段（如种子萌发、幼苗生长、成年个体繁殖交配期）发展的生境条件，入侵种可以逐步扩展并发生大规模的爆发，在自然生态系统、农业生态系统，以及城镇庭院、城郊、撂荒地、河岸、公路、铁路沿线等广泛分布，最终形成单优势种群落。

    在校园周边地区踏查，调查不同生境中入侵植物种类、空间分布格局、生长情况、危害程度、伴生植物种类、分布生境条件，通过群落学实验方法，了解植物入侵的趋势，比较分析入侵植物对群落结构的影响，最后提出合理的防控措施。

    {供参考的实验流程}

    1.文献资料查阅：通过文献资料，了解本地区危害严重的入侵植物3~5种，掌握其基本的生物生态学特性、入侵概况和防控对策。

    2.踏查选择样地：选取3~5个不同程度遭受外来植物入侵的草本群落，同时选择一处没有入侵植物的草本群落。在每个群落中设置3个1m*1m样方。

    3.按本书“校园内植物群落多样性调查”中介绍的方法，描述生境条件，测定生态因子，调查群落的种类组成，然后进行多样性计算。

    4.分析入侵植物对群落结构的影响，包括各群落中物种种类、群落多样性、各物种的重要值。

    5.分析各群落生境的土壤pH值、土壤含水量、土壤紧实度、光照状况等生态因子状况。另外，在条件允许的情况下，在所调查的不同入侵群落中用梅花形取样方法取土样，带回实验室，测定下列指标：土壤有机质、土壤全N、土壤全P、可溶性P、土壤全K、可溶性K等（每个样品应做3次重复分析）。

    6.在分析入侵植物对群落结构及群落生态环境影响的基础上，提出防控对策。

    {实际应用}

    通过对校园及周边地区的外来入侵植物状况进行综合的群落学调查与分析，可以认识入侵植物对自然生态环境、生物多样性及农林业生产等造成的巨大损失，提高学生的生态学综合实验技能与环保意识。

    实验拓展2入侵植物与本土植物的资源分配策略

    生物在进化过程中，为了保证种群的适合度达到最佳水平，其生活史会发展出一种最适的生态对策（即生活史对策），并在生物量配置、能量投资、生殖对策等方面表现出来。

    一般认为，在一个资源有限的环境中，植物所获得的物质和能量是有限的，投入到某一功能（生活史特征）的资源量增加必然会降低投入到其他功能的资源量，即在植物的生长、维持、繁殖等功能之间存在着“此消彼长”的权衡关系。而植物必须要权衡好这些方面的关系，才能使其适合度达到最高。生物量配置即是植物权衡其器官（根、茎、叶、花、果实）功能之间关系的一种表现。而生殖分配则是一定时间下植物权衡生殖和营养功能关系的具体体现。

    本实验可在之前的实验拓展1的基础上进行拓展。通过对校园生境的实地踏查，调查入侵植物种类、分布、生长情况，伴生植物种类及入侵物种的危害程度，然后，选择入侵物种及群落内的其他伴生植物，测定这些物种在不同群落内的生物量配置格局及生殖分配状况，使学生了解入侵植物与本土植物的资源分配策略。

    {实验材料的选择}

    可选择之前的实验拓展1所调查的群落。

    {供参考的实验流程}

    1.取样：选取生长状况一致或接近、发育良好的入侵植物5~10株，同时选取群落内的其他植物5~10株（如少于5株，则全取），将其连根挖起。

    2.样品处理和称重：将所取各物种的植株带回实验室后洗净，晾干，将植物分割成根、茎、叶、花、果实等部分，分装在不同的纸袋中，放置在85°C的烘箱内烘24h至恒重，用电子天平称各器官干重，将数据记录在表。

    3.生物量配置和生殖分配：依据以下公式计算出各器官的生物量配置及生殖分配。

    计算出每个个体的生物量配置和生殖分配后，填入表，求出每个物种种群各器官的生物量分配和生殖分配的平均值。

    4.数据分析：用Excel或SPSS 11.0处理数据，分析入侵物种在不同群落中的生物量配置和生殖分配的异同，以及同一群落中入侵物种与其他物种在生物量配置和生殖分配的异同，并用图表的形式表示出来。同时，探讨入侵物种与其他物种生物在资源分配和环境之间的关系。

    {操作要点}

    1.挖取植株时，注意保证植株的完整性。

    2.在分割植物各器官时，不同的植物采用不同的处理方法。如一些莎草科、禾本科植物或菊科植物中的某些种，由于茎的短缩（如禾本科的分蘖），应特别注意分离。

    3.有些植物的花和果实难以分开（如菊科的蒲公英），此时可将花和果实混在一起计算生物量配置，计为（花十果）生物量配置，事实上即为生殖分配。

    {实际应用}

    入侵植物种类繁多，在生长发育过程中，其资源获取及配置特征应引起注意。该实验可让学生了解植物资源分配的研究方法。

    实验3.2光周期对植物花期的调控作用

    【实验目的】

    1.了解生物的光周期现象及光周期的诱导机理。

    2.了解植物光周期反应的类型。

    3.初步掌握利用光周期控制植物花期的基本技术。

    【实验原理】

    植物通过感受昼夜长短变化而控制开花的现象称为光周期现象。某些植物（如小麦、玉米等）每日接受光照的时间必须超过某个数值才能开花，被称为长日照植物；某些植物（如水稻、大豆等）每日接受光照的时间必须少于某个数值才能开花，被称为短日照植物。研究表明，叶是感受光周期影响的器官，叶内形成某些特殊的代谢产物，传递到生长点，导致生长点形成花芽。

    植物在达到一定生理年龄时，经过足够天数（周期数）的适宜光周期处理，以后即使处于不适宜的光周期下仍然能开花，这种诱导效应叫做光周期诱导。植物所需的适宜光周期数，也会因植物种类、年龄及环境条件的不同而不同。如苍耳、水稻、浮萍等只需要1个短日照周期，其他短日照植物，如大豆需要2~3d，菊花需要12d；油菜、菠菜等需要1个长日照光周期，其他长日照植物，如天仙子需要2~3d，拟南芥需要4d，一年生甜菜需要13~15d，胡萝卜需要15~20d。当短于其诱导周期的最低天数时，不能诱导植物开花；而增加光周期诱导的天数则可加速花原基的发育，花的数量也增多。

    本实验以短日照植物为材料，探讨光周期的光照时间和周期数对其蕾期或始穗期的影响。

    【实验仪器和材料】

    1.仪器与设备

    暗箱或暗室、日光灯、定时开关自动控制装置。

    2.材料

    短日照植物（如大豆、苍耳、水稻、菊花等）的种子或幼苗。

    【操作建议】

    1.材料选择

    以大豆、水稻和苍耳为例，选择长出第一片复叶的大豆幼苗，或长出五六片叶的水稻或苍耳幼苗。

    2.实验处理

    除对照组外，其余处理组在暗箱内进行。

    （1）自然光照：为对照组。

    （2）短日照：每日给予光照8h，即通过定时开关设置每天早上8时至下午4时进行光照，周期数为1或3个，然后从暗箱移至自然光照处。

    （3）长日照：每日给予光照14h，即通过定时开关设置每天早上5时至下午7时进行光照，周期数为1或3个，然后从暗箱移至自然光照处。

    3.实验记录

    记录上述植物在各种处理下的蕾期或始穗期。

    【实验注意事项】

    1.培养环境的夜温应在20°C以上。

    2.培养土质要好，适当浇水，使土壤保持一定的水分。

    3.大豆黑暗期需要超过9.5~10h，至少两三个周期数；苍耳黑暗期需要超过8.5h，至少1个周期数；水稻黑暗期需要超过12h，至少1个周期数；菊花黑暗期需要超过9h，至少12个周期数。

    【实验拓展】

    实验拓展光照期和黑暗期在诱导植物开花中的作用

    多数植物是依据黑暗期的绝对长度来作出开花反应的。所谓长日照植物实际上是它们的黑暗期不能超过其临界值；而所谓短日照植物实际上是说它们的黑暗期必须超过某临界值。然而，黑暗期的相对长度不是光周期现象中的决定因子。如果用短时间的黑暗打断光期，并不影响光周期成花诱导；旦如果通过插入短时间的光照来中断黑暗期，则使短日照植物不能开花而继续营养生长，却诱导了长日照植物开花。

    本实验的拓展方向为研究光照期和黑暗期在植物光周期诱导中的地位和作用。具体来说，就是在光照期中插入一个短暂的黑暗期，以打断光照期；或在黑暗期中插入一个短暂的光照期，以打断黑暗期，从而观察和了解黑暗期和光照期在诱导植物开花中的作用。此外，以相同的光照期/黑暗期比例，设置不同的光周期模式，从而初步了解黑暗期、光照期的绝对长度和相对长度对植物开花的重要性。

    {实验材料的选择}

    选择长出五六片叶的苍耳幼苗。

    {供参考的实验流程}

    1.实验处理

    （1）间断白昼，即在短光照基础上每天中午12时至下午2时移入暗室（或用黑布罩住）间断白昼2h；

    （2）间断黑夜，在短光照基础上，在夜间增加1h光照；

    （3）在暗室内给予8/16的光周期；

    （4）在暗室内给予4/8的光周期。

    2.处理1~2个周期后，采用自然光培养，观察并记录蕾期。

    {实际应用}

    利用光周期控制观赏植物的开花时间。

    实验3.3不同生态系统中土壤有机质含量的测定

    【实验目的】

    1.理解土壤在生态系统中的重要作用及土壤有机质对土壤生物的影响程度。

    2.了解土壤有机质含量测定的基本原理，掌握测定方法。

    【实验原理】

    土壤有机质是土壤中各种形态有机化合物的总称。它包括土壤中未分解和半分解的各种动植物残体、微生物代谢产物及其分解与合成的各种有机形态（腐殖质）三类物质。土壤有机质既是植物矿质营养和有机营养的源泉，又是土壤中异养型微生物的能源物质，同时也是形成土壤结构的重要因素。土壤有机质直接影响土壤的耐肥性、保墒性、缓冲性、耕性、通气状况和温度等，因此，土壤有机质是鉴别土壤肥力的重要标志。土壤有机质含量是指单位体积土壤中含有的各种动植物残体、微生物代谢产物及其分解合成的有机物质的数量，一般以有机质占干土重的百分数表示。

    目前，土壤有机质含量的测定常使用重铬酸钾容量法。其原理是在加热并有硫酸存在的条件下，用过量的重铬酸钾溶液氧化土壤中的有机碳，多余的重铬酸钾用标准的硫酸亚铁溶液进行滴定，根据消耗掉的重铬酸钾的量来间接计算土壤中有机碳的含量，进而根据土壤中有机质与有机碳的比例（即换算因数）计算土壤中有机质的含量。目前，我国多采用Van Benmmelen换算因数计算土壤中有机质的含量，即土壤有机质中平均含碳量占58%，所以用有机碳的分析结果乘以1.724即换算成土壤有机质的含量。此外，采用重铬酸钾法并不能完全氧化土壤中的有机化合物，因此需要用一个校正系数来校正未反应的有机碳的含量，一般认为该方法所氧化的有机碳仅为实际含量的90%，即校正系数为1.1。该方法具体反应过程如下：

    氧化反应2K₂Cr₂O₇+8H₂SO₄+3C2Cr₂（SO₄）₃+2K₂SO₄+3CO₂+8H₂O

    滴定反应K₂Cr₂O₇+6FeSO₄+7H₂SO₄Cr₂（SO₄）₃+3Fe₂（SO₄）₃+K₂SO₄+7H₂O

    在滴定的过程中，使用邻啡罗啉氧化还原指示剂来指示滴定终点。邻啡罗啉指示剂变色的氧化还原标准电位为1.14V，要求浓度为4~6mol·L+1。在反应过程中，邻啡罗啉分子可与亚铁离子络合，形成红色的邻啡罗啉亚铁络合物[Fe（C₁₂ H₈N₂）3]²+，当遇到强氧化剂时，则变为淡蓝色的正铁络合物[Fe（C₁₂ H₈ N₂）₃]。在整个反应过程中溶液颜色的变化表现为：滴定开始以重铬酸钾的橙色为主，滴定过程中出现了Cr³+的绿色，与正铁络合物的淡蓝色混合，溶液呈现蓝绿色，当过量的重铬酸钾强氧化剂消耗完毕，标准硫酸亚铁过量半滴，溶液呈现亚铁络合物的棕红色，表示已到滴定终点。

    【实验仪器和材料】

    1.仪器和设备

    分析天平、硬制试管（18~80mm）、油浴锅、铁丝笼、温度计（0~200°C）、电炉、滴定管、5mL移液管、漏斗、三角瓶、量筒、草纸或卫生纸等。

    2.材料

    （1）0.1333mol·L+1重铬酸钾溶液：称取经过130°C烘3~4h的分析纯重铬酸钾39.216g，溶解于400mL蒸馏水中，必要时可加热溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000mL，摇勾备用。

    （2）0.2mol·L-1硫酸亚铁或硫酸亚铁铵溶液：称取化学纯硫酸亚铁55.60g或硫酸亚铁铵78.43g，溶于蒸馏水中，加6mobL+1硫酸1.5mL，再加蒸馏水定容到1000mL备用。

    （3）硫酸亚铁溶液的标定：准确吸取3份0.1333mol·L+1重铬酸钾标准溶液各5.0mL于250mL三角瓶中，各加5mL 6mol·L_1硫酸溶液和15mL蒸馏水，再加入邻啡罗啉指示剂3~5滴，摇匀，然后用0.2mob L4硫酸亚铁溶液滴定至棕红色为止，其浓度为c=6*0.1333*5.0/V

    式中，c为硫酸亚铁溶液的摩尔浓度，mol·L-1为用去的硫酸亚铁溶液的体积，mL；6为6mol硫酸亚铁与1mol铬酸钾完全反应的摩尔系数比值。

    （4）邻啡罗啉指示剂：称取化学纯硫酸亚铁0.695g和分析纯邻啡罗啉1.485g溶于100mL蒸馏水中，贮于棕色瓶中备用。

    （5）石蜡（固体）或磷酸或植物油2.5kg。

    （6）6mol·L-1硫酸溶液：在2体积水中加入1体积硫酸。

    （7）浓硫酸：化学纯，密度为1.84*10³kg.m-3。

    【操作建议】

    1.采集不同类型生态系统（如森林生态系统、农田生态系统、城市生态系统等，根据情况自行选择两三种；或在某山地的阴坡和阳坡分别选取坡谷、坡麓、坡中、坡顶4个生境）的土壤样品，准确称取通过60号筛的风干土样0.1~0.5g（称取的量依据有机质含量而定），放入干燥的硬制试管中，用移液管准确加入0.1333mol·L-1重铬酸钾溶液5mL，再用量筒加入浓硫酸5mL，小心摇匀。

    2.在试管上加一小漏斗，将试管插入铁丝笼内，放入预先加热至185~190°C的油浴锅内，此时将温度控制在170~180°C，自试管内大量出现气泡开始计时，保持溶液沸腾5min，取出铁丝笼，待试管稍冷却后，用草纸擦净试管外部油液，放凉。

    3·经冷却后，将试管内溶物洗入250mL的三角瓶中，使溶液的总体积达60~80mL，加入邻啡罗啉指示剂3~5滴，摇匀。

    4.用标准的硫酸亚铁溶液滴定，溶液颜色由橙红（或黄绿）经绿色突变到棕红色即为终点，数据记录在表。

    5.在滴定样品的同时，必须做两个空白实验，取其平均值，空白实验用石英砂或灼烧的土代替土样，其余步骤同上。

    6.有机质含量计算

    P=c（V₀-V）*0.003*1.724*1，1/m

    式中，P为有机质含量，g/kg；c为标准硫酸亚铁的摩尔浓度，mol·L-1；V。为空白实验消耗的硫酸亚铁溶液的体积，mL；V为待测土样消耗的硫酸亚铁溶液的体积，mL；m为烘干土重，g；0.003为0.25mmol碳的克数；1.172为由土壤有机碳换算成有机质的换算系数；1.1为校正系数（用此法氧化率为90%）。

    【实验注意事项】

    1.注意硫酸具有强腐蚀性。

    2·土壤采集需具代表性。对于每个生态系统或生境的土壤，取三四个50cm*50cm的样方，每个样方分4层（可根据具体情况设定）：0~5cm、5~10cm、10~15cm和15~20cm。

    【实验拓展】

    实验拓展土壤有机质含量与土壤动物间的相互作用在土壤生态系统中，土壤的理化性质（如有机质含量等）能够影响土壤动物的种类、丰度和分布等；反之，土壤动物能够改变或改善土壤的理化性质：两者是相互作用和相互影响的。

    随着农业的大力发展和土地资源的城市化，土壤的结构和组成发生了不同程度的变化。例如，土壤动物与农业耕作制度及管理方式密切相关，农业耕作或施肥在改变了土壤某些理化性质的同时，也改变了土壤动物生存的环境，导致土壤动物种类的复杂程度和总数量减少。土壤动物区系和土壤动物多样性的研究也已经成为土壤生态学研究的热点和前沿。

    本实验的拓展方向为研究土壤有机质含量对土壤动物的生物多样性或对某种土壤动物的种群密度的影响，同时也涉及某种或多种土壤动物的接种对土壤有机质含量的影响。

    {实验材料的选择}

    可从农田或其他生态系统的土壤内捕捉的某种大型土壤动物，如蚯蚓等。

    {供参考的实验流程}

    1.土壤有机质含量对土壤动物的生物多样性和种群分布的影响

    （1）采集某种生态系统或不同生态系统的土壤，采集方法参考上述“不同生态系统中土壤有机质含量的测定”的内容。

    （2）分离特定土层内的土壤动物，计算土壤动物的生物多样性，以及某种土壤动物的种群密度和年龄结构。

    （3）测定特定土层的有机质含量。

    （4）统计各土层有机质含量或不同生态系统土壤有机质含量对土壤动物的多样性和分布的影响，以及对某种土壤动物的种群密度、分布特征和年龄结构的影响。

    2.某种或多种土壤动物对土壤有机质含量的影响

    （1）将采集到的土壤置于花盆或其他透气性较好的容器内，共分4个处理组，每组含3个平行组（3盆土壤）。测定该土壤的初始有机质含量。

    （2）4个实验处理：第1组为对照；第2组花盆内添加定量的面包片等有机物（可作为蚯蚓的食物）；第3组花盆内接种一定量的蚯蚓（50~200条/盆），但不添加食物；第4组花盆内接种蚯蚓并定量提供食物。根据环境温度和食物利用情况，确定处理时间。

    （3）实验处理后土壤有机质的测定：如在室温（25°C）条件下，约1~2周（或隔周，或持续数周）后测定土壤有机质的含量。

    （4）利用统计学软件比较接种蚯蚓或添加食物（外源有机物质）对土壤有机质含量的影响，分析这两种因素之间的交互作用。也对各处理组蚯蚓的数量和质量进行统计，分析种群动态与土壤有机质含量变化的关系。

    {操作要点}

    1.土壤的条件要适合蚯蚓生长。避开阳光直射，适时浇水，使土壤保持一定的湿度。

    2.花盆或其他容器的容积适中，能防止蚯蚓外逃。单位重量土壤内蚯蚓的数量（或质量）需尽量一致。

    3.蚯蚓喜食淀粉含量高的食物。

    4.在测定土壤有机质含量前，应去除土表残留的食物，并将蚯蚓从土壤中挑出。

    {实际应用}

    利用土壤动物来改良土壤结构。

    实验3.4重金属污染对植物叶绿素含量的影响

    【实验目的】

    1.了解重金属污染对叶绿素含量的影响。

    2.掌握叶绿素含量的测定方法。

    3.了解叶绿素含量在重金属胁迫条件下的变化趋势。

    4.绘制重金属浓度与叶绿素含量的剂量效应曲线。

    【实验原理】

    高等植物叶绿素分叶绿素a和叶绿素b，其含量的高低是反映植物光合能力的一个重要指标。叶绿素含量的变化可以反映污染对植物光合作用的影响。

    重金属污染是当今世界上备受重视的一类公害。一方面，当重金属离子进入植物体时，它一会抑制原叶绿素酸醋还原酶的活性，二会影响S-氨基-Y-酮戊酸的合成，而这两种物质又是叶片合成叶绿素所必需的酶和原料，从而使叶绿素含量下降；另一方面，重金属毒害会引起叶绿体在叶肉细胞中排列紊乱、细胞内膜结构破坏，这也会导致叶绿素含量降低。

    【实验仪器和材料】

    1.仪器和设备

    培养皿、光照培养箱、电子天平、剪刀、研钵、滤纸、容量瓶、漏斗、分光光度计等。

    2.材料

    （1）植物种子：根据当地环境和实验条件选择合适的植物种子。本实验推荐用小麦种子。

    （2）试剂：用去离子水配制Cd²+（硝酸铅）或Cr6+（重铬酸钾）的系列溶液（浓度分别为0、10、25、50、100mg·L-1）。

    【操作建议】

    1.实验材料的准备：小麦种子经5%NaClO溶液消毒15min后，用去离子水冲洗数次，在20°C浸种12h，然后挑选饱满一致的种子转移至铺有双层湿滤纸的20cm培养皿中，置光照培养箱中培养。

    2.染毒处理：待小麦长出2片真叶后，标记培养皿，分别用5个不同浓度的重金属溶液处理。每个浓度做3个平行处理。每2天用蒸馏水冲洗1次，再用原相应浓度的重金属溶液培养。另外，应设置对照组。各个浓度的小麦苗培养1周后，即可进行叶绿素提取分析。

    3.叶绿素的提取：称取植物叶片0.1~0.5g，剪碎放入研钵中，加入少量石英砂，将叶片研成糊状。用80%丙酮溶液分批提取叶绿素，直到残渣无色为止。将丙酮提取液过滤后定溶至50mL。

    4.叶绿素的测定：以80%丙酮溶液为对照，分别测定在波长为663nm、645nm处提取液的吸光度。如果浓度较高，可以用80%丙酮溶液适当稀释后再测定。可根据下列公式求算叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素的浓度。

    5.实验记录及分析：叶绿素的测定结果记录在表，每个处理组的最终结果用“平均值±标准误差”表示，并用F检验分析不同处理组间的差异性。根据数据，利用Excel作出相应的统计图形和剂量效应曲线。

    【实验注意事项】

    1.叶绿素提取过程中应尽量避免光照，以免叶绿素见光分解。同时可适当加温以加快提取速度，但要补充因挥发而减少的丙酮。

    2.有些植物材料细胞间质的酸度很高，在磨碎过程中会使叶绿素脱镁成为去镁叶绿素，从而降低了测定值。因此，在磨碎这些材料时要加入pH=8.0的缓冲液一起研磨，并适当提高丙酮浓度，使混合后的丙酮浓度达到80%。

    3.由于叶绿素a与叶绿素b的吸收峰波长仅相差18nm（663nm—645nm），仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大偏差，因此最好能用光分辨率高的分光光度计，如751型。

    【实验拓展】

    实验拓展利用叶绿素指标筛选尾矿中的耐铅植物

    该实验的拓展方向为根据不同植物叶绿素对重金属的不同响应，初步筛选重金属的耐受性植物。

    随着人们对环境保护的日益重视，迫切需要寻找在不破坏土壤物理化学性质的前提下治理重金属污染的新途径，其中植物修复是首选方法。露天堆积的金属尾矿是非常严重的污染源，能够在其上面自然定居的植物必然对重金属有一定的耐受性。将这类植物种植于重金属污染地，使其富集重金属，经几次收割后，土壤中的重金属水平显著减少，从而达到修复土壤的目的。

    本实验将通过温室沙培的方法，对生长于铅锌尾矿区的一系列植物进行筛选。由于叶绿素是植物进行光合作用的物质基础，叶绿素含量的变化必然影响植株的正常发育。当重金属处理组的植物叶片的叶绿素含量明显低于对照组时，说明该种植物的生长已受重金属的影响；否则说明该植物对重金属污染具有较强的耐受性。因此，本实验选择叶片的叶绿素含量作为初步筛选重金属耐受性植物的指标。

    {实验材料的选择}

    供试植物：选择铅锌尾矿废弃地上的自然物种5~20种。采集植物种子，苗床育苗。待幼苗长出1片真叶，从苗床上挖取长势一致的幼苗，用蒸馏水洗净根系泥土，供栽培用。

    实验用沙：市售建筑用沙过2mm筛，用2%HNO₃溶液浸泡过夜，用蒸馏水洗干净，500g装1盆。

    {供参考的实验流程}

    1.每盆栽植幼苗2棵，喷洒Hoagland's营养液。

    2.幼苗正常培养20d后，对植物浇灌醋酸铅处理液（400mg·L-1），每种植物品种做3个重复盆，每个品种均设有空白对照。

    3.培养60d左右，采集植株叶片，测定叶绿素值，具体测定方法参考上述“重金属污染对植物叶绿素含量的影响”中的内容。

    {操作要点}

    1.在对植株浇灌营养液或铅处理液时，每次浇灌量和浇灌次数应尽量一致。

    2.采集植物叶片时，为使结果有可比性，最好在植株固定位置采样，或取植株数个位置的叶片做一个混合样品。

    {实际应用}

    为筛选重金属耐受性植物提供依据。

    实验3.5水生植物对水体污染的净化作用

    【实验目的】

    1.学习和掌握水体污染常规指标的测定方法。

    2.熟悉不同种类的水生植物对水体污染的净化能力。

    3.了解不同性质污染水体的生物学处理方法。

    【实验原理】

    水体污染的性质与污染物的性质有直接关系。含重金属盐的印染废水、制革废水、电镀废水和农药、除草剂等可造成水体的毒污染；含高浓度氮、磷的生活废水可造成水体的富营养化。针对不同性质污染的水体，净化处理的方法也有区别。

    不同种类的水生植物对毒污染和富营养化的净化能力也不同。某些水生植物以富集有毒物质为主，有些则以降解有毒物质为主。即使是以富集方式为主的水生植物，富集能力也相差很大，富集的能力的高低可通过检测处理前后水生植物体内某些指标的含量得知。水体中的氮、磷是水生植物生长的必需元素，它们被植物吸收后进入代谢过程，一般不会产生二次污染。但是，许多重金属和部分农药、除草剂等不易分解，即使进入植物体，仍将积累在植物体内，随着水生植物的死亡腐烂又将回归水体，容易造成二次污染；如果将水生植物捞至地面又易造成土壤污染。因此，一般将富含上述物质的植物烘干燃烧成灰分集中深埋处理。

    水体污染的性质和程度可通过许多常规指标（如水中溶解氧含量、氨氮含量、总磷含量、pH值、某种重金属含量等）的检测得到了解。本实验建议检测水中溶解氧含量、氨氮含量和pH值，在有条件的实验室，还可以检测总磷含量和多种重金属含量。

    通过本实验，可以了解不同种类的水生植物对不同性质水体污染的净化能力，为今后利用生物学手段处理水污染打下基础。

    【实验仪器和材料】

    1.仪器和设备

    pH计、分光光度计、玻璃培养缸（50cm×30cm×50cm）、溶解氧瓶、三角瓶、滴定管、水样采集器等。

    2.材料

    （1）可选用在我省各地广泛分布的水菌芦、金鱼藻、黑藻（Hydrilla verticillata）、眼子菜（Potamogeton distinctus）、小茨藻（Najas minor）、水塞（Aponogeton lakhonensis）、苦草（Vallisneria natans）、水他（Narcissus tazetta）等。本实验以水菌芦和黑藻为例。

    （2）试剂：分析纯浓硫酸、0.0100mol·L-1硫酸锰溶液、0.1000mol·L-1硫代硫酸钠溶液、碱性碘化钾溶液（称500g分析纯氢氧化钠溶于300~400mL蒸馏水中，150g分析纯碘化钾溶于200mL蒸馏水中，然后将上述2种溶液合并）、淀粉溶液、钠氏试剂（50g分析纯碘化钾，放入50mL无氨蒸馏水中，制成碘化钾溶液。取21g二氧化汞溶于少量水中，制成饱和溶液，后逐滴加入碘化钾溶液，不断搅拌，直至红色沉淀不再溶解为止，加入400mL 35%氢氧化钠溶液，最后加无氨蒸馏水1000mL，静置24h，取上清液于带橡皮塞的棕色玻璃瓶中）、酒石酸钾钠溶液（溶解50g酒石酸钾钠晶体于蒸馏水中，再稀释至200mL，然后加入5mL钠氏试剂，混合后静置三昼夜使其澄清备用）、硫酸锌溶液（10g化学纯硫酸锌溶于无氨蒸馏水中，稀释至100mL）、氢氧化钠溶液（25g氢氧化钠溶于少量无氨蒸馏水中，稀释至50mL）等。

    【操作建议】

    1.实验材料采集：根据实验需要采集适量的水葫芦和黑藻。将其中的部分材料称其鲜重并烘干，再测其干重（用于计算干/鲜重比）、氮含量（有条件的实验室，还可测含磷量和某几种重金属的含量）。

    2.污染水样采集：在某些污染水体或某些工厂的废水排水口处，采集实验水样（具体的采集方法请参考本书1.1.6的内容。因本实验需要水样量比较大，1个实验小组只需采集1类水样即可，各实验小组可分别用不同的水样进行实验），并测定这些水样的溶解氧含量、氨氮含量、pH值及某几种重金属含量等。

    3.水生植物处理：将采集到的污染水样置于5个玻璃培养缸中，在4个培养缸中放置适量（需称其鲜重）水葫芦（如用黑藻作实验材料，需在玻璃培养缸底放适量的底泥，并测定氮含量、pH值或某几种重金属含量）进行培养；另外1个玻璃培养缸中不放养水葫芦，作为对照。以后每隔1周，取对照缸中和其他1个培养缸中的部分水体，测定溶解氧含量、氨氮含量、pH值、某几种重金属含量；取该培养缸中的水葫芦烘干，测其干重，再粉碎，测其氮含量、某几种重金属含量。重复此操作，持续1个月左右。

    4.常规指标的检测：请参考本书1.1.7中“生态环境污染监测常用的分析技术”的内容。

    5.实验记录及分析：将上述测定结果记录在表，并分析实验结果。

    【实验注意事项】

    1.每个实验缸中植物样应控制等重。

    2.不同的实验小组可用不同的水生植物材料进行试验。

    3.植物样干重的计量，可以先称其鲜重，然后根据干/鲜重的比值进行换算（参见上述操作建议”1的内容）。

    【实验拓展】

    实验拓展底栖动物对水体底泥中污染物的净化作用

    水体的污染物除了溶解在水中的物质外，还有相当一部分积累在底泥中。本实验的拓展方向为利用另外一类生物来净化水体中的沉积物。

    底栖动物是指生活史的全部或大部分时间生活于水体底部的水生动物。栖息的形式多为固着于岩石等坚硬的基体上和埋没于泥沙等松软的基底中。在摄食方法上，以悬浮物摄食和沉积物摄食居多。多数底栖动物长期生活在底泥中，具有区域性强、迁移能力弱等特点。不同种类底栖动物对环境条件的适应性及对污染等不利因素的耐受力和敏感程度不同。因此，利用底栖动物生长过程中吸收和富集底泥中污染物的特点，在一定程度上可以对水体起到净化作用；同时也可以通过对底栖动物种群结构、优势种类、数量等指标的分析，判断水体的质量状况。

    {实验材料的选择}

    底栖动物种类很多，在淡水水体中常见河蚌、田螺等螺。本实验建议用田螺。

    {供参考的实验流程}

    1.实验动物采集：田螺可以在周边的水稻田中采集或从农贸市场上购买。将其中的部 分材料称其鲜重并烘干，再测其干重（用于计算干/鲜重比）、氮含量（有条件的实验室，还可测含磷量和某几种重金属的含量）。

    2.污染底泥采集：在某些污染水体或某些工厂排放的废水水体下，采集实验底泥，同时也采集该水体的水样（1个实验小组只需采集1类底泥样品即可，各实验小组可分别用不同的底泥样品进行实验，采集方法请参考本书1.1.7中“生态环境样品的野外采集技术”中的相关内容），并测定底泥样品的氮磷含量、pH值及某几种重金属含量等。

    3.实验处理：在每个玻璃培养缸底放适量的底泥，放入适量的水（前述所采集的水样），淹没底泥（一般超过底泥上表面5cm左右），放入定量的田螺（且各培养缸中的田螺等量）进行培养；另外1个玻璃培养缸中不放养田螺，作为对照。以后每隔1周，取对照缸中和其中1个培养缸中的部分底泥，测定其氮磷含量、pH值、某几种重金属含量；取该培养缸中的田螺烘干，测其干重，再粉碎，测其氮磷含量、某几种重金属含量。重复此操作，持续1个月左右。

    4.指标检测、结果记录和分析：将测定的各项指标进行对比分析，比较用底栖动物处理前后底泥中各污染物含量的变化及底栖动物体内污染物含量的变化，推测底栖动物对底泥中各污染物的净化能力。

    {实际应用}

    可为利用生物学方法净化水体提供理论依据和新的思路。

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